A mikrobiom mélyrétegei

Az első részben megismertük a mikrobiális ökoszisztémát. A másodikban beléptünk a működés világába: fermentáció, rövid szénláncú zsírsavak, cross-feeding, bélbarrier és immunrendszer. Most elérkeztünk ahhoz a ponthoz, ahol már nem elég megkérdezni, milyen mikroorganizmusok vannak jelen. Azt kell megértenünk, hogyan tudjuk őket mérni, milyen géneket hordoznak, mely gének aktívak, milyen molekulákat állítanak elő – és hogy mindebből milyen következtetést szabad levonni.

A mikrobiomkutatás egyik legfontosabb felismerése ugyanis az, hogy egy mikrobiális közösség taxonómiai összetétele és biológiai funkciója nem ugyanaz.

Két ember mikrobiomja fajszinten jelentősen eltérhet.

Mégis lehetnek olyan alapvető metabolikus funkciók, amelyek mindkettőben megtalálhatók.

Más esetben két látszólag hasonló közösség működése térhet el jelentősen.

Egyetlen kérdés helyett öt különböző kérdés

Amikor valaki azt mondja: „megvizsgálták a mikrobiomot”, az önmagában még nem árulja el, hogy pontosan mit mértek.

A különböző módszerek ugyanis egészen eltérő kérdésekre válaszolnak.

16S rRNS – a mikrobiomkutatás klasszikus eszköze

A baktériumok és archeák riboszómájának kis alegységéhez tartozó 16S rRNS gén bizonyos régiói evolúciósan konzerváltak, más részei viszont változékonyabbak.

Ez lehetővé teszi, hogy a gén egyes szakaszainak szekvenálásával következtessünk arra, milyen baktérium- és archeacsoportok találhatók egy mintában.

A módszer óriási szerepet játszott a mikrobiomkutatás fejlődésében.

Viszonylag költséghatékony, nagyszámú minta vizsgálható vele, és jól használható a mikrobiális közösségek taxonómiai összehasonlítására.

De vannak korlátai.

A felbontás gyakran nem elegendő megbízható törzsszintű azonosításhoz, és önmagában nem méri közvetlenül a közösség teljes funkcionális génkészletét.

Ha azt látjuk, hogy egy baktériumcsoport jelen van, abból még nem tudjuk biztosan, hogy:

• pontosan mely törzsek vannak jelen,
• milyen géneket hordoznak,
• mely géneket használják,
• és milyen metabolitokat termelnek.

Shotgun metagenomika – amikor már nem egyetlen marker-gént vizsgálunk

A shotgun metagenomika más megközelítést használ.

Nem egyetlen kiválasztott gént amplifikálunk, hanem a mintában található DNS széles spektrumát szekvenáljuk.

Ezzel lényegesen részletesebb információ nyerhető a mikrobiális közösség genetikai tartalmáról.

Megvizsgálható többek között:

• milyen mikrobiális gének vannak jelen,
• milyen anyagcsereútvonalakra lehet genetikai kapacitás,
• milyen rezisztenciagének fordulnak elő,
• bizonyos esetekben milyen törzsek azonosíthatók,
• illetve metagenom-összeállítással részleges vagy közel teljes mikrobiális genomok rekonstruálhatók.

De fontos a „lehet”.

A DNS jelenléte genetikai potenciált jelent.

Nem bizonyítja, hogy az adott gén az adott pillanatban aktív.

Metagenom: amit a rendszer megtehet
Metatranszkriptom: amit éppen próbál megtenni

A DNS viszonylag stabil.

Az RNS sokkal dinamikusabb.

A metatranszkriptomika a mikrobiális közösségben található RNS-molekulák vizsgálatával igyekszik feltérképezni, mely gének expresszálódnak az adott állapotban.

Ez új szintet nyit.

Tegyük fel, hogy egy mikroorganizmus genomjában megtalálható egy butiráttermeléshez szükséges génkészlet.

A mikrobiom ugyanis nem statikus genetikai könyvtár.

Az étrend, a rendelkezésre álló szubsztrátok, a pH, a gazdaszervezet fiziológiája és más mikroorganizmusok jelenléte mind befolyásolhatja, milyen mikrobiális gének fejeződnek ki.

Metaproteomika – a következő réteg

Az RNS jelenléte sem jelenti feltétlenül azt, hogy abból működő fehérje keletkezett.

Itt lép be a metaproteomika.

Ez a mikrobiális közösségben jelen lévő fehérjék széles körű vizsgálatára törekszik.

A fehérjék között vannak:

• enzimek,
• transzportfehérjék,
• strukturális fehérjék,
• jelátviteli komponensek.

Ezért a metaproteomika még közvetlenebbül kapcsolódhat a működéshez.

És itt megjelenik egy különösen érdekes fogalom: funkcionális redundancia.

Funkcionális redundancia – különböző mikrobák, hasonló feladat

Tegyük fel, hogy két ember bélmikrobiomja jelentősen különbözik fajösszetételében.

Az egyik emberben egy adott metabolikus feladatot az „A” mikroorganizmus végzi.

A másikban ugyanazt a funkciót a „B” mikroorganizmus látja el.

Taxonómiailag tehát különböznek.

Funkcionálisan azonban lehet átfedés.

Ez az ökológiából ismert jelenség különösen fontos a mikrobiom esetében, mert segíthet megmagyarázni, miért létezhet óriási fajszintű különbség egészséges emberek között úgy, hogy közben bizonyos alapvető biokémiai funkciók fennmaradnak.

Metabolomika – amikor már nem azt kérdezzük, ki van ott

Elérkeztünk talán a mikrobiomkutatás egyik legérdekesebb rétegéhez.

A metabolomika a rendszerben található kis molekulák széles körét vizsgálja.

Ezek között lehetnek:

• mikrobiális eredetű metabolitok,
• gazdaszervezetből származó metabolitok,
• táplálékból származó molekulák,
• illetve olyan vegyületek, amelyeket előbb a gazdaszervezet, majd a mikrobiota – vagy fordítva – alakított át.

Itt megszűnik az egyszerű határ a „mi anyagcserénk” és „a baktériumok anyagcseréje” között.

A gazdaszervezet és mikrobiota egymás után módosíthatja ugyanazt a molekulát.

A metabolomika ezért sok esetben közelebb kerülhet a tényleges biológiai fenotípushoz, mint önmagában a mikrobiális fajlista.

A triptofán három világa

A triptofán esszenciális aminosav.

De a bélrendszerben ennél sokkal több történik vele.

A rendelkezésre álló triptofán több különböző metabolikus útvonal felé indulhat.

A gazdaszervezetben többek között részt vehet a kynurenin útvonalban, illetve szerotoninképzéshez kapcsolódó folyamatokban.

A mikroorganizmusok viszont különféle indolszármazékokat hozhatnak létre belőle.

Ilyenek lehetnek például:

• indol,
• indol-3-acetát,
• indol-3-propionát,
• indol-3-laktát,
• indol-3-aldehid.

Ezek közül több olyan jelátviteli rendszerrel kerülhet kapcsolatba, mint az aryl hydrocarbon receptor – AhR, vagy bizonyos esetekben a pregnane X receptor – PXR.

De itt is óvatosság kell.

Az, hogy egy metabolit sejtkultúrában vagy állatmodellben egy bizonyos hatást mutat, még nem jelenti automatikusan azt, hogy emberben ugyanaz a hatás klinikailag jelentős.

Epesavak – az ember által gyártott molekulák, amelyeket a mikrobiom újraír

Az epesavak kiváló példái a gazdaszervezet és mikrobiom közös kémiájának.

A máj koleszterinből primer epesavakat állít elő.

Ezek az epével a bélrendszerbe kerülnek.

A nagy részük visszaszívódik.

De ami eljut a distalis bélrendszerbe, azt bizonyos mikroorganizmusok tovább alakíthatják.

Mikrobiális enzimek többek között:

• dekonjugálhatják,
• dehidroxilálhatják,
• oxidálhatják,
• epimerizálhatják

az epesavakat.

Így komplex szekunder epesav-pool alakulhat ki.

Az epesavak pedig nem pusztán a zsíremésztést segítő detergensek.

Receptorokon keresztül jelátviteli molekulák is.

TMA és TMAO – amikor egy étrendi molekula története több szervezeten halad keresztül

A trimetilamin – TMA és trimetilamin-N-oxid – TMAO története jól mutatja, mennyire bonyolult a mikrobiális metabolizmus értelmezése.

Bizonyos bélmikroorganizmusok képesek trimetilamint előállítani több olyan prekurzorból, amelyek az étrendben is megtalálhatók.

Ilyen lehet például:

• kolin,
• foszfatidilkolin,
• L-karnitin.

A mikrobiálisan képződő TMA felszívódik.

A májban többek között flavin-tartalmú monooxigenázok – különösen az FMO3 – oxidálhatják.

A TMAO magasabb keringő koncentrációja számos megfigyeléses vizsgálatban összefüggést mutatott kardiometabolikus kockázatokkal, de a teljes oksági lánc értelmezése összetett.

Miért nem elég a „jó baktériumból több” gondolkodás?

Most már látható, mennyire félrevezető lehet a mikrobiomot egyetlen mikroorganizmus köré építeni.

Tegyük fel, hogy egy baktériumfaj jelenléte epidemiológiailag kedvező egészségi állapothoz társul.

Ez még nem mondja meg:

• hogy maga a baktérium okozza-e a kedvező állapotot,
• milyen törzséről van szó,
• mit eszik az adott mikroorganizmus,
• milyen metabolitokat termel,
• milyen mikrobiális partnerei vannak,
• milyen környezetben működik,
• és hogyan reagál rá az adott ember szervezete.

Alfa-diverzitás: sokféleség egyetlen mintán belül

Az első részben már találkoztunk a diverzitás fogalmával.

Most pontosítsuk.

Az alfa-diverzitás egy mikrobiális közösségen belüli változatosságot próbálja számszerűsíteni.

A különböző indexek ezeket eltérően súlyozhatják.

Például a Shannon-index nem egyszerűen megszámolja a taxonokat, hanem azok eloszlását is figyelembe veszi.

Béta-diverzitás: mennyire különbözünk egymástól?

A béta-diverzitás azt vizsgálja, milyen mértékben különbözik két vagy több közösség összetétele.

Ehhez különböző távolságmetrikák használhatók.

• Bray–Curtis disszimilaritás,
• Jaccard-index,
• UniFrac távolság.

Ezek nem ugyanazt mérik.

Egyesek az abundanciát is figyelembe veszik.

Mások elsősorban a jelenlétet vagy hiányt.

Az UniFrac filogenetikai információt is beépít.

Ez azért fontos, mert amikor egy tanulmány azt írja: „a két csoport mikrobiomja szignifikánsan különbözött” , az eredmény értelmezéséhez tudnunk kell:

• milyen metrikával?
• milyen mintavétellel?
• milyen statisztikai modellel?
• mekkora volt a hatás?

Relatív abundancia – a mikrobiom egyik matematikai csapdája

Ez az egyik legfontosabb, mégis ritkán elmagyarázott probléma.

A mikrobiomadatok jelentős része relatív abundancián alapul.

Tegyük fel, hogy egy mintában:

Később A baktérium abszolút mennyisége ugyanannyi marad, B baktériumé viszont megduplázódik.

Az új relatív arány:

Ha csak százalékot nézünk, azt hihetnénk: A baktérium csökkent.

Pedig abszolút értelemben nem változott.

Ez az úgynevezett kompozicionális adatprobléma egyik egyszerű példája.

Mintavétel: a kutatás már azelőtt eldőlhet, hogy bekapcsoljuk a szekvenálót

A mikrobiomkutatásban az analitikai módszer csak az egyik probléma.

Előtte ott van: a mintavétel.

Számíthat:

• mikor történt,
• hogyan történt,
• mennyi idő telt el a feldolgozásig,
• milyen hőmérsékleten tárolták,
• milyen tartósítóanyagot használtak,
• milyen DNS- vagy RNS-extrakciós protokollt alkalmaztak.

Ezután számít:

• milyen szekvenálóplatformot alkalmaztak,
• milyen primerpárt használtak,
• milyen adatbázishoz hasonlították a szekvenciákat,
• milyen bioinformatikai pipeline futott,
• milyen minőségellenőrzési szabályokat alkalmaztak.

A széklet nem a bél

Ezt a második részben már kimondtuk.

Most menjünk egy lépéssel tovább.

A bél mikrobiális ökológiája térben strukturált.

Más környezetet jelent:

• a vékonybél,
• a proximális vastagbél,
• a distalis vastagbél,
• a lumen,
• a nyákréteg,
• a mucosához közeli régió.

Más lehet:

• a pH,
• az oxigéngrádiens,
• az epesav-koncentráció,
• a szubsztrátkínálat,
• az áthaladási idő,
• az immunológiai környezet.

Idő: a hiányzó negyedik dimenzió

A mikrobiom nemcsak térben változik.

Időben is.

Egyetlen székletminta pillanatfelvétel.

De a mikrobiális közösséget befolyásolhatja:

• az előző napi étrend,
• a hosszabb távú étkezési minta,
• gyógyszer,
• fertőzés,
• utazás,
• alvás,
• fizikai aktivitás,
• béltranzit,
• hormonális és élettani állapot.

Ezért a longitudinális vizsgálatok – amikor ugyanazt az embert többször mérjük – sokszor jóval informatívabbak, mint egyetlen keresztmetszeti mérés.

Asszociációtól a kauzalitásig

Ez a mikrobiomkutatás egyik legnehezebb útja.

Először megfigyeljük:

Ez asszociáció.

Ezután megpróbáljuk kideríteni: van-e mechanisztikus kapcsolat?

Ehhez többféle bizonyíték szükséges lehet:

• longitudinális humán vizsgálatok,
• kontrollált étrendi intervenciók,
• mechanisztikus sejtes kísérletek,
• állatmodellek,
• mikrobiális tenyésztési rendszerek,
• metabolitvizsgálatok,
• bizonyos esetekben mikrobiota-transzfer kísérletek.

Minél több független bizonyítéki vonal ugyanabba az irányba mutat, annál erősebb lehet az oksági következtetés.

De még ekkor is számít:

Egy csíramentes egér nem ember.

Egy sejttenyészet nem vastagbél.

Egy metabolit farmakológiai dózisa nem feltétlenül felel meg annak a koncentrációnak, amely természetes körülmények között kialakul.

Hol tartanak a kereskedelmi mikrobiomtesztek?

Ez az a pont, ahol a tudomány találkozik a piaccal.

Technikailag ma már nagyon részletes mikrobiális profil készíthető egy székletmintából.

Ez azonban nem ugyanaz, mint egy validált klinikai diagnosztikai rendszer.

Egy kereskedelmi teszt megmutathat mikrobiális taxonokat és bizonyos esetekben becsülhet vagy mérhet funkcionális jellemzőket.

De ebből még nem feltétlenül következik, hogy tudjuk:

• mi az adott személy számára optimális érték,
• az eltérés oka vagy következménye-e valaminek,
• hogyan kell azt célzottan módosítani,
• és hogy a módosítás klinikai előnyt fog-e okozni.

A személyre szabott mikrobiomtáplálkozás ígérete

A mikrobiomkutatás egyik legizgalmasabb lehetősége a személyre szabott táplálkozás.

Az elképzelés logikus.

Ha két ember:

• eltérő mikrobiális közösséggel,
• eltérő metabolikus kapacitással,
• eltérő gazdaszervezeti genetikával,
• eltérő életmóddal

rendelkezik, akkor ugyanarra az ételre sem feltétlenül reagálnak azonos módon.

A probléma azonban a predikció.

Ahhoz, hogy egy mikrobiomadat alapján megbízható étrendi ajánlást adjunk, bizonyítani kellene:

• a biomarker reprodukálható,
• a reakció előre jelezhető,
• a beavatkozás valóban módosítja a célzott funkciót,
• és ennek klinikailag releváns előnye van.

A multi-omika – ahol a jövő valószínűleg keresendő

A mikrobiomkutatás fejlődési iránya egyre világosabb.

Nem egyetlen adatfajtát kell nézni.

Hanem rétegeket.

Ehhez társulhat:

• gazdaszervezeti genomika,
• transzkriptomika,
• epigenomika,
• immunprofilozás,
• klinikai fenotípus,
• táplálkozási adatok,
• térbeli mikrobiomadatok.

Ezt nevezzük multi-omikai integrációnak.

A mikrobiom egyik legfontosabb leckéje

Minél mélyebbre jutunk a mikrobiomban, annál kevésbé működnek az egyszerű mondatok.